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【实验】KM小鼠四氯化碳化学性急性肝脏损伤建模实验报告

楼层直达

图片:捕获XXXX.JPG


_________________________________________________________________________________________________________

参考文献


1 周琼 小鼠急性肝损伤模型的建立及GSTA1分析 东北农业大学 2012年6月8日
2 石岩 阿奇霉素诱导小鼠急性肝损伤模型的建立及其分子病理的研究 河南科技大学 2013年5月
3 刘颖姝 急性肝损伤早期诊断指标GSTA1的研究及保肝药物初筛东北农业大学 2013年6月
4 周琼 刘芳萍 刘颖姝 赵玉林 李昌文 李睿 张秀英 四氯化碳致小鼠急性肝损伤动物模型建立方法的研究 东北林业大学学报 2012年6月 第43卷第6期 中图分类号:S854 文章编号:1005-9369(2012)-0077-06
5 王心如 周宗灿 毒理学基础第五版 人民卫生出版社 ISBN978-7-117-08887-9
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沙发F
1引言
肝脏是一个拥有代谢、消化、吸收、解毒、存储及维持生物体内水电解质平衡、激素平衡、免疫、制造多种凝血因子还有维持血液循环,生产胆汁的重要的中心器官,在肝脏保护机体的同时,又易被各种毒物、药物和有毒化学品及体内的代谢产物所损伤,而从事药物生产和化工专业的人员来说,由于接触的化学品往往都带有一定的肝毒性,所以此类人群的肝脏都会有不同程度的受损,而肝脏的代偿能力是内脏中最为强盛的一个,往往只有在肝脏功能严重受损时才会被人所发觉,往往此时以晚,肝脏已受到了不可逆的损害。当肝脏发生严重的病变时,还会导致全身的物质代谢、消化系统、循环系统、内分泌系统的改变和负荷加重,严重时可导致机体生理功能的崩溃导致患者死亡。现代医学对肝脏的功能和损伤检测与判断格外重视,目前的肝功能检测已成为学生入学、职工入职体检和年检的重要项目之一,其中的肝损标记物如:AST/ALT/HA/ET/MDA/SOD/GSH-Px等现已经成为临床上应用与诊断肝损的主要内容,在这些标记物中AST和ALT这两项血清生化指标由于推广良好和与其自身的显著的活性,已经成为最为常见和主要的肝损指标。
而临床实验室的相关检测也愈来愈多,项目也愈来愈精细,但在肝脏的初检方面依然较大程度的依赖于AST和ALT,通过本次的实验,可以让学生们详细的观察到肝脏在受到损伤时血清中ALT的变化,直面观察肝脏的损伤。
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板凳F
1.1 肝脏作为毒作用靶器官的原因
在机体内肝脏具有特殊的解剖位置、组织结构与生理生化特性,肝脏最以作为外来化学的毒作用的靶器官。肝脏是一个被血液充盈的器官,与血液系统密切相连,由于肝脏存在门静脉与肝动脉两套入肝血管,分别接受来自胃肠静脉与体循环的动脉血液,化学物质无论从何种途径进入机体,最终均可以通过血液循环迅速达到肝脏,尤其从消化道吸收的化学毒物,在进入血液循环以前毒物首先与肝脏接触。肝脏作为化学毒物生物转化的主要器官,在一定条件下,化学毒物极易对肝脏造成损害作用,特别是经体内代谢增毒的外源化学物质在肝脏代谢转化后其有毒代谢产物可首先损害肝脏。另外,由胆汁排泄的的有毒化学物质或代谢产物,可通过肝-肠循环系统再次入肝发挥毒作用。因此,肝脏是化学毒物的重要毒作用靶器官。
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地板F
1.2 急性肝损伤
肝损伤是由各种肝脏疾病所产生的病变结果,目前临床上造成急性肝损伤的原因主要有药物使用不当、饮酒过量、误服有毒食物、放射线以及化工生产中所接触的具有肝脏毒性的化学品。
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4楼F
1.3 化学性肝损伤
   化学性肝损伤由化学性肝脏毒物质的毒效应下造成的肝损伤,能造成肝脏细胞膜与酶类的破坏,从而造成肝脏细胞的功能障碍,导致细胞的凋亡与坏死,进一步造成整个肝脏正常生理功能的障碍。化学性肝损伤基本因素为细胞应激、线粒体损伤、特异性免疫反应等,这些始动因素又可以进一步启动信号通路等下游事件,导致线粒体通透性转换孔开放,引起细胞的凋亡与坏死。
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5楼F
1.3.1 CCl4肝损伤概述
CCl4所导致的小鼠急性肝损伤是经典的化学性肝损伤模型。CCl4作为亲肝毒物,通过任何途径与动物接触均可被迅速吸收,广泛存在于各组织中,通过肝脏、肺脏和其他组织代谢。CCl4肝毒性呈依赖性关系,因此可以引起不同程度的损伤,少量给予CCl4可诱发急性肝损伤产生,导致肝细胞的变性、坏死;慢性或多次反复次级可导致纤维组织增生,最后可形成肝硬变。
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6楼F
1.3.2 CCl4致急性肝损伤的机制
关于的CCl4肝毒作用机制,存在多种意见,但都一致公认CCl4在肝脏中代谢形成自由基是导致急性肝损伤的主要原因。CCl4进入机体后,在细胞色素P450酶,特别是CYP 2E1代谢下,生成三氯甲基自由基(·CCl3)和氯自由基(Cl·)等一系列活性氧自由基。·CCl3可以与疏基反应,例如GSH的疏基和蛋白质疏基。与细胞蛋白质共价结合是最终导致脂质过氧化和细胞坏死的一系列反应的使动因素。·CCl3对肝细胞进行直接攻击,从而影响线粒体结构和功能,使酶蛋白合成受阻,影响肝脏代谢功能和能量生成,致使肝细胞变性坏死。自由基还可以损伤DNA,破坏核酸分子的完整性和构型。自由基通过引起DNA链的断裂或改变其特殊密码、改变合成DNA模板的结构、使DNA多聚酶发生错误旋转等途径对造成损伤,影响其信息传递功能以及转录和复制特性,改变癌基因和抑癌基因的活性状况,最终可引发细胞增殖失控而至癌变。明确肝损伤作用机制可以为沿疗肝脏疾病提供理论基础,为寻找和幵发新的保肝护肝药物提供有效途径。
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7楼F
1.3.3 CCl4致急性肝损伤的影响因素
1.3.3.1 自由基
自由基是指游离存在的带有不成对电子的分子、原子或离子等,是具有失去或得到电子而成对的极活泼的化学物质。活性氧由基(ROS)是正常组织的氧代谢产物,体内抗氧化系统使其产生与清除保持低水平的动态平衡,处于对机体有利的状态。病理条件下,ROS可以调节各种免疫和炎症分子的表达,导致炎症反应加剧和组织损伤,并造成对生物大分子蛋白质、DNA等的损伤。高水平的损伤细胞并涉及人类肝纤维化和肝硬化病变的发生发展。QuB等研究发现ROS活性氧族引起肝细胞损伤机理十分复杂,目前尚不完全清楚。CCl4进入机体后,在细胞色素P450代谢下,生成三氯甲基自由基(•CCl3)和氯自由基(Cl•)等一系列活性氧由基。•CCl3对肝细胞进行直接攻击,抑制细胞膜和微粒体膜上钙泵活性,使钙离子内流增多,从而引起肝细胞坏死。自由基引发的脂质过氧化LPO不但可以损伤细胞膜,还可牵连发生一系列病理反应。NO是一种常见活性氧由基,低浓度时对维持机体功能有重要作用。CCl4可诱导NO产生增多,NO通过调节线粒体电子链的传递或控制DNA的合成诱导细胞调亡对氧化损伤起放大作用。NO还可以使肝细胞对TNF-α的敏感性提高,从而使肝细胞更易受损。
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日月六芒星之辉光 发布于2017-04-29 10:13
8楼F
1.3.3.2 氧化应激
目前普遍认为引起CCl4肝损伤主要与自由基的形成及引发的链式过氧化反应有关。CCl4可以引起肝脂质过氧化反应,产生ROS可引起肝细胞膜、线粒体膜、微粒体膜及溶酶体膜发生脂质过氧化,加剧肝脏的损伤。ROS可促发多不饱和脂肪酸的LPO,反应中产生的各种中间过氧化产物也具有损伤作用。ROS及LPO可改变或灭活多种琉基酶类的活性,有研究表明,在CCl4引起的肝损伤早期,GSH储备严重耗竭,GSH在有毒代谢产物解毒过程中有重要作用。GSH与CCl4有毒代谢物形成加合物,从而促使CCl4的解毒。引起肝损伤起始靶部位是质膜,质膜破坏引起连锁反应,使Ca2+跨膜内流增加,大量涌入细胞并主耍聚集在线粒体内,钙平衡紊乱,导致线粒体和肝细胞损伤。
1.3.3.3 炎性因子
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日月六芒星之辉光 发布于2017-04-29 10:21
9楼F
额。。。炎性因子内容我有点蒙,先不写了这个因素了。。。
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日月六芒星之辉光 发布于2017-04-30 17:33
10楼F
1.3.4 CCl4急性肝损伤动物模型
CCl4 肝损伤模型是一种经典的实验研究模型
因其结果稳定、可靠、重现性好,所以被前人广泛用作保肝药物的筛选CCl4溶于食用油,配置成0.5%浓度,以 10ml/kg 的剂量给予小鼠腹腔注射,根据实验所需时间(24h)将小鼠处死,监测反应肝功能的相应指标ALT,并且做组织病理学检查。CCl4之所以通过肝细胞中的内质网来对肝细胞的损伤、坏死造成一定影响,是由于氯自由基和 CCl3的产生,并不断变化着,作用着进一步的促进膜的直接溶解作用,海刺激了脂质中的过氧化反应,这些都是由于代谢着的氧化酶,通过细胞色素 P450 所存在的多方面功能来完成的;但是脂质过氧化可以使线粒体和肝细胞的功能和结构的完整性遭到破坏,因此导致了能量代谢障碍;三氯甲基自由基还可以使细胞膜的通透性不断增加,钙离子大量的内流,导致细胞膜中产生了明显的浓度梯度;加上 CCl3  
在此同时可以破坏溶酶体膜,使细胞内大量的转氨酸派放到血液中,其中包括黄嘌呤氧化酶的转化和膜磷脂的分解;多数的水解蛋白酶逐步被释放出来,抑制线粒体膜和细胞膜的正常功能
,譬如呼吸和活性;血清转氨酶活性的指标在肝损伤的过程中是极其有意义的
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日月六芒星之辉光 发布于2017-04-30 17:34
11楼F
1.4 ALT值在肝脏损伤研究中的应用
血清转氨酶共有 20 余种,主要作用就是催化氨基酸与酮酸之间的氨基转移。其中以血清谷丙转氨酶和血清谷草转氨酶活性最强。测定两种血清转氨酶活性是反映肝细胞变性坏死的常规检测指标。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)是通常所称的谷丙转氨酶,在急性肝炎中,ALT 显著升高,尤其对无黄疸、无症状肝炎的早期诊断更有帮助,其阳性率高,阳性出现时间较其他试验早,其活性的高低随肝病的进展和恢复而升降,据此可观察病情及预后。在慢性肝炎、肝硬化、肝癌等 ALT活性轻度升高。另外一些胆道疾病、心肌和骨骼肌损伤也可引起 ALT 的升高。
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日月六芒星之辉光 发布于2017-04-30 17:34
12楼F
1.5 本实验的目的与意义
本次实验是为探究CCl4对肝脏的损害作用与其血清ALT和病理表现,从而推断日常生活中其他化学品对肝脏的损害作用与致病因素。
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日月六芒星之辉光 发布于2017-05-01 09:35
13楼F
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验动物
昆明系小鼠,体重30g±2g,雌雄混养,普通级,购自北京。小鼠适应性词养由摄食和饮水,温度保持25℃,自由光照,定时通风换气。
该鼠种详细资料见此网站:http://www.gdmlac.com.cn/index.php?q=node/64

图片:2.jpg


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14楼F
2.1.2 主要试剂

试剂

规格

等级或厂家

四氯化碳

500ml

AR

福尔马林

500ml

AR

生理盐水

500ml:4.5g

NaCl
  0.9%

蒸馏水

500ml

双蒸

植物油

50ml

食用花生油

ALT试剂盒

2,4-二硝基苯肼法

长春汇力

图片:1.jpg

图片:3.jpg

图片:4.jpg

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15楼F
2.1.3溶液配制
2.1.3.1 CCl4溶液配制
用微量移液器吸取1 m
L CCl4加入 19 m L 花生油中,配制 20 m L浓度为5%的CCl4油溶液,以此溶液为基础液。采用倍比稀释方法配制0.5%浓度的 CCl4油溶液。

图片:6.jpg

在通风橱内打开试剂瓶

图片:7.jpg

用移液器吸取所需四氯化碳

图片:8.jpg

将四氯化碳与植物油相混合,配成0.5%四氯化碳油溶液
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日月六芒星之辉光 发布于2017-05-02 21:29
16楼F
2.1.4仪器设备
材料名称 规格 型号 厂家 数量 单位
移液器 20-200μl TopPette单道手动可调移液器 DRAGONMED 1 支
移液器枪头 200μl 200μl X1000 CYPRESS 1 包
枪头盒 200μl X 96 200μl X96 CYPRESS 1 个
离心管 10ml 10ml圆底扣盖X100 CYPRESS 1 包
灌胃针头 12#55mm小头直 12#55mm小头X1 中科生命 1 根
注射器 1ml 1ml0.45x15 JIUKANG 3 支
注射器 1ml 1ml0.5x20 山川 3 支
注射器 60ml 60ml32x1.6 山东新华安得 1 支
注射器 20ml 20ml1.6x30 JIUKANG 2 支
橡胶手套 中号 一次性橡胶含粉 南昌飞翔乳胶 7 副
隔离帽 中号 蓝X10 永康洁 10 个
医用口罩 大号 无纺布蓝X20 KANGMIN 20 个
紫外可见光分光光度计 190-1100nm UV-5800PC 上海元析 1 台
离心机 低速离心机 LDZ4-1.2 北京时代之利 1 台
水浴锅 0-100℃ HH-S4 金坛医疗设备 1 台
显微镜 生物显微镜 UB100i 重庆光学 1 台
显微镜 生物显微镜 —— 奥林巴斯 1 台
显微镜 生物显微镜 FZ-10 重庆光学 1 台
电子分析天平 0.1g JY10001 LIANG PING 1 台
比色皿 1cm 721 —— 14 个
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17楼F
仪器照片
 

图片:1.jpg


图片:2.jpg

图片:3.jpg

图片:8.jpg

图片:7.jpg

图片:4.jpg

图片:5.jpg

图片:6.jpg

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18楼F
2.2 方法
2.2.1 ALT活性检测方法
参考试剂盒使用说明书:
检验方法—1、3、4、5步骤,忽略第二步骤。

图片:问请问v.jpg


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19楼F
今日期末考试结束~准备回归论坛~嘿嘿
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